在多色流式實(shí)驗(yàn)中，熒光溢漏是導(dǎo)致通道信號難區(qū)分、設(shè)門不準(zhǔn)確的核心原因。隨著檢測指標(biāo)增多，熒光素光譜重疊的概率增加，單一熒光的溢漏會被多色疊加放大，整體熒光溢漏情況持續(xù)變化——這種情況下，未染色的空白對照（未涉及熒光溢漏干擾）或全通道同型對照（無法覆蓋多色交叉溢漏）均無法模擬全染背景，尤其對分群不明顯、低表達(dá)量指標(biāo)（需從大量陰性群體中識別陽性信號），必須依賴減一對照(FMO對照，F(xiàn)luorescence Minus One)排除干擾。減一對照，又稱熒光扣除對照或圈門對照，是多色流式分析中針對特定通道的陰性對照。其操作邏輯為：對目標(biāo)通道不進(jìn)行熒光染色，其余所有檢測通道均按目標(biāo)樣本的染色方案完整染色，以此模擬“全染背景下，僅目標(biāo)通道無特異性信號"的場景。

該對照主要應(yīng)用于：研究不同細(xì)胞亞群的表型分子（如免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物）、細(xì)胞因子等指標(biāo)的檢測，尤其適用于多色（≥3色）實(shí)驗(yàn)或低表達(dá)指標(biāo)分析。

1.排除全染背景干擾：通過“缺失一個(gè)通道熒光"，直觀區(qū)分“目標(biāo)通道的特異性信號"與“其他通道溢漏至該通道的非特異性信號"；

2.評估熒光溢漏程度：量化其他熒光染料向目標(biāo)通道的溢漏比例，為補(bǔ)償調(diào)節(jié)和設(shè)門提供精準(zhǔn)依據(jù)；

3.確保設(shè)門準(zhǔn)確性：在低表達(dá)、分群模糊的場景中，明確陰性群體的信號邊界，避免因溢漏信號誤將陰性細(xì)胞判定為陽性。

樣本中死細(xì)胞的存在會極大地影響染色效果，因?yàn)樗兰?xì)胞具有更大的自發(fā)熒光，而且會增加非特異性的抗體結(jié)合，導(dǎo)致假陽性并增加背景信號，降低陽性信號的動態(tài)范圍，這可能會使弱陽性樣本和稀有細(xì)胞群體的鑒定變得困難。還可能會釋放DNA，DNA非常黏稠，會導(dǎo)致細(xì)胞成團(tuán)，容易堵塞管路。此外，死細(xì)胞無法刺激表達(dá)活化功能相關(guān)的標(biāo)志物，從而導(dǎo)致一些比真實(shí)陽性率低的假陰性結(jié)果產(chǎn)生。使用基于FSC和SSC的門可以幫助清除部分碎片和死細(xì)胞，但無法全部移除，因此需要借助靈敏且特異性的染料對細(xì)胞進(jìn)行活性分析。其原理是利用細(xì)胞死亡后的通透性改變來做特異性熒光標(biāo)記，常見染料包括DNA染料類，分為兩種，一種是膜不透過性染料（如PI、7-AAD），僅標(biāo)記死細(xì)胞；另一類是膜透過性染料（如 Hoechst 33342），可標(biāo)記活細(xì)胞核，常用于活細(xì)胞示蹤或與 PI 聯(lián)合使用進(jìn)行死活雙染。而熒光標(biāo)記的Annexin V檢測凋亡細(xì)胞，可結(jié)合外翻的磷脂酰絲氨酸。此外，還可以通過對細(xì)胞大小變化及理化性質(zhì)的測定進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。

其它實(shí)驗(yàn)對照，用于比較特定實(shí)驗(yàn)條件下樣本之間的差別，主要分為以下幾個(gè)類別：

1.陰性對照能夠提供所有待測標(biāo)志物的表達(dá)背景，用于比較細(xì)胞經(jīng)過化學(xué)或生物學(xué)處理后的蛋白表達(dá)差異，例如細(xì)胞內(nèi)染色實(shí)驗(yàn)涉及固定和破膜，這些步驟會影響抗原檢測、自發(fā)熒光、熒光染料亮度和細(xì)胞形態(tài)。

2.陽性對照用于證實(shí)抗體在相關(guān)細(xì)胞中的陽性染色，以表明抗體在實(shí)驗(yàn)中起作用。

3.縱向?qū)φ?/span>/參考對照是長期研究的質(zhì)量控制，可以確保實(shí)驗(yàn)過程中的染色一致性。